亚克隆重组质粒的构建，技术服务

一、实验材料准备

原始重组质粒：这是亚克隆的起始材料，包含了我们感兴趣的目的基因以及可能的其他无关序列。原始重组质粒通常是之前构建好的，其来源可以是实验室保存的菌株或者是通过其他实验方法获得的。

亚克隆载体：根据实验目的和后续应用选择合适的亚克隆载体。例如，如果后续要在原核细胞中表达目的基因，可选择含有原核启动子和合适的筛选标记（如氨苄青霉素抗性基因）的载体；若要在真核细胞中表达，则需选择具有真核启动子、增强子、 poly (A) 信号等元件的载体。同时，载体应具备合适的多克隆位点（MCS），以便目的基因的插入。

酶类及缓冲液：需要限制酶来切割原始重组质粒和亚克隆载体，不同的限制酶识别特定的核苷酸序列。同时还需要 DNA 连接酶来连接目的基因和载体，以及相应的酶切和连接反应缓冲液，这些缓冲液能为酶提供适宜的反应环境，保证酶活性的稳定。

二、目的基因获取

使用特定的限制酶对原始重组质粒进行酶切，以获取目的基因片段。选择限制酶时，要依据目的基因两侧的酶切位点来确定。酶切反应通常在适宜的温度（如 37℃）下进行，反应时间根据酶的活性和质粒的量而定。在酶切过程中，要确保反应体系的准确性，包括酶的用量、缓冲液的体积、DNA 的量等，以保证酶切的完全性，使目的基因能完整地从原始重组质粒中释放出来。

三、载体准备

对亚克隆载体也使用与目的基因获取相同的限制酶进行酶切，使载体产生与目的基因相匹配的粘性末端或平末端。这样在后续的连接步骤中，目的基因和载体能够通过碱基互补配对或其他方式进行连接。酶切后的载体可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化，去除未被完全酶切的载体和其他杂质，提高连接反应的效率。

四、连接反应

将获取的目的基因片段和酶切后的亚克隆载体按照一定的摩尔比（一般目的基因稍过量，如 3:1 左右）混合，加入 DNA 连接酶和连接缓冲液，在合适的温度下（如 16℃过夜或室温数小时，不同连接酶要求可能不同）进行连接反应。连接酶催化目的基因和载体之间形成磷酸二酯键，将它们连接成一个完整的重组分子。

五、转化与筛选

转化：将连接产物导入到合适的宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌。转化方法包括热激转化和电转化等。例如在热激转化中，将感受态的大肠杆菌细胞与连接产物在低温下混合，然后进行短暂的热激处理，使细胞膜通透性增加，重组质粒进入细胞。

筛选：利用亚克隆载体上的选择标记对转化后的细胞进行筛选。如果载体含有氨苄青霉素抗性基因，就在含有氨苄青霉素的培养基上培养转化后的大肠杆菌。只有成功摄取了重组质粒的细胞才能在这种选择性培养基上生长，形成菌落。

鉴定：对筛选出的菌落进一步进行鉴定。可以采用菌落 PCR 的方法，使用针对目的基因的特异性引物进行扩增，检测是否有目的基因插入。还可以通过提取质粒后进行酶切鉴定，观察酶切片段的大小是否符合预期，以及通过测序分析来**确定亚克隆重组质粒构建的正确性，确保目的基因准确无误地插入到亚克隆载体中。

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状态：固体/粉末/溶液

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厂家：西安齐岳生物

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。