质粒构建、转化、扩增、提取及鉴定

质粒：一个小型环状双链 DNA 分子，存在于细菌染色体外，能独立复制并稳定遗传。

质粒分子小 (0.2-10 KD)，因此便于分离和提取，可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。

一、构建：带有 GFP 标记的 Parkin 过表达质粒

利用限制性内切酶消化获得线性化载体，PCR 扩增制备 Parkin 基因片段，所用扩增引物需在其 5' 端添加同源重组序列，使用该引物扩增基因片段，扩增产物 5' 和 3' 最末端的序列分别与线性化载体两末端序列完全一致。以线性化载体和基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现体外环化。

二、转化扩增：

（1）配置 LB 肉汤培养基及含 AGAR 的培养液 (含琼脂，用于配制LB固体培养基)，倒平板，接种阴性对照菌液和 Parkin 过表达菌液于固体培养皿中，并倒置于 37 ℃ 培养箱中孵育 16 h 左右；

（2）然后各挑取一个独立的、圆形且大小适中的菌落，接种于 5 mL 含抗生素的LB 培养液中，37 ℃，250 rpm，摇菌 10 h；（3）从两种 5 mL 的菌液中各取 1 mL 分别加入至 LB 培养液中，37 ℃，250 rpm，摇菌 14 h。

三、抽提和鉴定

扩增结束后可按照质粒抽提试剂盒对质粒进行提取。提取的 Parkin 过表达质粒和阴性对照质粒，进行测序。将测序结果与目的基因序列进行比对分析，后续进行质粒转染。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除