构建过表达基因质粒流程、特点

质粒：质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。DNA载体可使目的基因在细胞内表达以达到我们的研究目的。

通常具有以下几个特点

1.有一个或多个限制性内切酶的切点，便于目的基因插入；

2.带有标记基因（抗性基因、荧光基因等），便于筛选；

3. 大小合适（一般小于10kb），便于转染。

限制性内切酶：识别DNA序列中的回文序列，并对两条链上特定碱基之间的磷酸二酯键进行切割，大多来源于细菌，根据细菌种属而命名。选择限制性内切酶构建载体应注意：

1. 单酶切后载体容易自连必须去磷酸化，不能保证插入片段的方向；

2. 双酶切需要注意同尾酶的自连。

构建过表达基因质粒

表达基因扩增的引物设计：

1.NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列；

2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突；

3. CDS区首、尾序列 + 5’端加上酶切位点和（或）保护碱基

表达载体构建简要流程：

1.PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；

2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；

3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜，转化，鉴定。