慢病毒转染在CRISPR-Cas9系统中的重要意义，附实验步骤解析

推动生物技术领域的创新发展在生物技术领域，慢病毒转染的 CRISPR - Cas9 系统成为了创新的强大引擎。它广泛应用于基因敲除、插入以及修饰等研究中，帮助科学家们构建各种基因工程细胞系和动物模型，用于药物筛选、细胞治疗以及生物制药等方面的研究。例如，通过精确编辑细胞的代谢通路相关基因，可提高生物制品的生产效率；在动物模型构建中，能够快速模拟动物**状态，加速药物研发进程。

CRISPR慢病毒转染法是一种高效引入CRISPR基因编辑系统到目标细胞中的技术，旨在实现对基因的有针对性编辑或调控。

实验步骤：

1、质粒构建：构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒，其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列，可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因（之前已详细描述过）。

2、慢病毒包装质粒：准备慢病毒包装质粒，其中包括pCMV-VSV-G（携带包膜蛋白）和pCMV-dR8.2 dvpr（携带包装蛋白）。这两者协同作用，使得慢病毒能够高效地传递CRISPR-Cas9系统到目标细胞内。

3、细胞培养：使用适宜的培养基培养目标细胞，通常选择293T细胞，以确保细胞处于佳的生长状态。

4、转染试剂准备：在进行转染前，将培养基更换为适用于阳离子脂质体转染的Opti-MEM减血清培养基。同时，准备转染试剂，包括Lipofectamine 3000、助转剂P3000以及含有CRISPR-Cas9系统的质粒。

5、转染操作：将质粒混合物与转染试剂按照试剂盒的推荐比例进行混合，随后滴加到目标细胞上。此过程中，确保混合物与细胞充分接触，有利于转染效率的提高。

6、培养条件：将细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中，培养一定的时间，通常在48小时内。

7、收获：收集细胞上清液，通过离心去除细胞残渣。

8、滤膜过滤：使用0.22 μm孔径的聚醚砜滤膜过滤细胞上清液，以去除残留的细胞碎片和其他杂质。

9、慢病毒收获：得到的慢病毒上清液即为经过纯化和感染活性验证的慢病毒，可用于后续实验中对目标细胞进行感染（若病毒感染效率低，可使用试剂盒进行浓缩病毒）。

10、慢病毒感染：将目的细胞接种于 6孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染后48H，加入适量浓度的筛选药物puromycin（具体浓度通过药物筛选实验获得），24h后换液去除死细胞，继续传代维持培养。

注意事项：

1、病毒液应减少冻融次数，每一次冻融滴度会下降2-4，因此收毒时可进行分装以便后续使用。

2、转染时可加polybrene （可提高病毒转染效，需优化佳浓度(2–12 μg/ml))。

3、转染前先调整好细胞状态，收毒不宜太早，应在转染后48h之后收毒。

4、在进行实验时，可将培养皿中的细胞密度设置为4–5 x 10^6 cells/10 cm，若细胞分裂速率过快，可酌情减少铺板细胞数量，建议在细胞的汇合度达到50–80%时开始进行实验。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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