基因敲除的方法-同源重组、RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9系统

基因敲除是指使生物体基因组中的特定基因失活或失效的过程。这一技术通常通过引入突变来实现，从而使目标基因失去功能。基因敲除的方法主要包括同源重组、RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9系统。

同源重组：通过引入修饰的DNA片段，用无功能或被破坏的版本替换靶基因。当外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组时，靶基因被替换并失活。

RNA干扰（RNAi）：利用小RNA分子来沉默或降解靶基因的信使RNA（mRNA），阻止其翻译为蛋白质，从而实现基因敲除。

CRISPR/Cas9系统：使用引导RNA（sgRNA）和Cas9酶在基因组的特定位置引入靶向DNA断裂，导致基因破坏。CRISPR/Cas9通过非同源末端连接（NHEJ）修复途径，在断裂位点产生移码突变或片段缺失，使基因沉默，功能丧失

基于CRISPR/Cas9基因敲除(KO)的步骤：

分析敲除基因，确定敲除靶标位点；

设计并合成识别靶标位点的sgRNA；

构建基因敲除载体；构建基因敲除细胞株:依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式（脂质体、电转或病毒包装）；

将抗生素素筛选后分离的细胞克隆进行测序验证；

96孔板进一步筛选单克隆并测序，选择敲除纯合细胞株。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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