基因敲除的sgRNA设计原理

基因敲除是指使生物体基因组中的特定基因失活或失效的过程。通常是通过在靶基因中引入突变来实现的，使其失去功能。进行基因敲除的方法，包括同源重组、RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9。同源重组即通过引入修饰的DNA片段，用无功能或被破坏的版本替换靶基因；RNAi利用小RNA分子来沉默或降解靶基因的信使RNA（mRNA），阻止其翻译为蛋白质；CRISPR/Cas9是一种革命性的基因编辑工具，它使用引导RNA（sgRNA）和Cas9酶在基因组的特定位置引入靶向DNA断裂，导致基因破坏。

基因敲除的sgRNA设计原理

在 CRISPR-Cas9 系统中，sgRNA（small guide RNA，sgRNA）通过碱基互补配对原则引导 Cas9 蛋白酶 至基因组特定的靶序列上，Cas9 蛋白与 PAM 序列结合后便可对靶位点进行切割，形成 DNA 双链切口。sgRNA 设计的合理与否，对于 CRISPR-Cas9 编辑系统的切割效率，甚至后能否得到 KO 细胞具有重要影响。

目前虽然有诸多高效快速的 gRNA 设计工具，但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。sgRNA 的设计需要遵循以下原则：

(1) 不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域，且能影 响蛋白的功能结构域。

(2) 尽可能影响所有的转录本，敲除位点好在编码区的前 50%，但避免敲除 ATG 所在外显子或 ATG 之 前的外显子。

(3) 片段敲除的 sgRNA 设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后 序列尽量简单，方便后续的 PCR 鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非 3 的倍数，使靶区域后面 的序列发生移码。另外，片段敲除所选定的敲除区域不要超过 10 Kb，超过 10 Kb 后编辑敲除效率会降低。

(4) 在设计 sgRNA 时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC 含量、潜在的脱靶位点等信息。例如靶点的 GC%尽量不要低于 40%，靶点序列 GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不 要有连续 4 个以上的 T 碱基，避免形成 RNA Pol III 的转录终止信号等。

(5) 当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的 cell pool 阶段检测效率呈显著下 降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用 RNAi。

(6) 由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果 RNAi 始终做不出表型，但从有 关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做 KO；另外，研究的目的基因处于非转录区域，或者 目的基因有很强的转录效率，也是无法用 RNAi 进行有效干扰的，则建议做 KO，且 KO 细胞更适合进 行回补实验。

 (7) 后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用 RNAi 做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然 可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除