CRISPR/Cas9技术基因敲除鼠的构建

基因编辑小鼠主要分为基因敲除（KO）、条件性敲除（CKO）及基因敲入（KI）等几种方式。其中基因敲除鼠（KO）是基因编辑鼠中常用、也是容易构建的模型鼠，但是这样一种模型鼠的设计和构建过程依然复杂。本文就以CRISPR/Cas9技术为例，为大家科普一下基因敲除鼠的设计、构建、鉴定与使用方法。

基于CRISPR/Cas9技术基因敲除鼠的构建过程就如下图所示：主要包括其中，gRNA设计和筛选，sgRNA表达载体构建，显微注射，胚胎移植，小鼠培育及繁殖及小鼠基因型鉴定等过程。详情请点击（基因编辑鼠的构建）

sgRNA设计及表达载体构建

其中，sgRNA的设计是通过在目标基因N端编码序列中寻找合适的靶序列完成的，可以利用软件（sgRNA Designer）预测潜在sgRNA序列。经过在脱靶率预测后，在细胞中进行活性筛选后，取脱靶率较低的sgRNA构建打靶载体。随后将上述sgRNA与Cas9-mRNA一起注射入体外受精小鼠受精卵的胞浆部分，并将之移入假孕母鼠体内发育为子代小鼠。

小鼠基因型鉴定

胚胎移植后的小鼠约19天后出生，取子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定，即所谓的Founder，F0代。基因鉴定一般利用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction， PCR），即利用引物大量扩增目的片段。一般我们会选取目的片段上下游200-300bp长度的序列作为引物设计的对象。

①如果缺失的DNA片段有成百甚至上千个碱基，这样可以通过PCR产物长度来区分突变型和野生型小鼠基因型，较长即为未敲除片段，较短则为已敲除片段；

②如果缺失为几bp或者几十bp 无法通过PCR电泳图来区分野生型和突变型，那么需要进一步通过T7E1酶切或者测序的方法进行区分。如下图所示：

基因敲除纯合子（-/-）：只带有已敲除片段的小鼠为纯合子；

基因敲除杂合子（+/-）：同时带有已敲除和未敲除片段的小鼠为杂合；

野生型小鼠（+/+）：只带有未敲除片段；

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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