dCas9-SSAP，无切割(Cleavage-Free)基因敲入系统

基因编辑是基因组和细胞工程的强大工具。以CRISPR–Cas为例，基因编辑可能导致DNA损伤并触发DNA修复过程，而这些过程往往容易出错。当改变长序列时，这种不想要的突变和安全问题可能会更加严重。作者将微生物单链退火蛋白（SSAP）与无催化活性的dCas9偶联用于基因编辑。这种无切割的基因编辑器dCas9–SSAP促进哺乳动物细胞中长序列的敲入。dCas9–SSAP编辑器具有较低误差和小的偏离，显示出比出传统Cas9方法更高的准确性。它对插入数量级为千的碱基规模的序列是有效的，效率高达约20%。作者进一步对其进行了截短和适体改造，以大限度地减小其大小，以适应未来应用的单个腺相关病毒载体。总之，这一工具为更安全的长序列基因组编辑提供了一种方法。

假设SSAP可能不依赖于DNA切割，并不具有ATP依赖性，基于这一假设，作者设计了一个系统，将SSAP招募到催化失活的dCas9中（图1）。dCas9蛋白不能切割DNA，但保留了解开靶位点并形成R环的能力，使非靶链被认为可用于SSAP刺激的同源重组。为了测试这一点，作者设计并评估了三种主要的微生物SSAP：λ噬菌体Bet、大肠杆菌Rac原噬菌体RecT和噬菌体T7 gp2.5。作者通过RNA适体MS2将SSAP募集到化脓性链球菌Cas9的失活版本-dSpCas9（以下简化为dCas9）中（图2）。

将该MS2适体插入单一引导RNA（sgRNA）支架中，并将候选SSAP与特异性结合MS2适配体的C末端MS2外壳蛋白（MCP）融合，从而使多个SSAP与dCas9 gRNA形成复合物。

为了测量它们在人类细胞中的基因编辑活性，作者用编码荧光蛋白表达盒的800bp转基因提供供体，该荧光蛋白表达盒两侧有同源臂（HA），该同源臂允许荧光蛋白插入持家基因框架内，例如DYNLT1、HSP90AA1和ACTB（图3）。

在敲入后，作者测量了荧光蛋白表达细胞的百分比，以量化基因编辑效率（图4）。作者的测试表明，相对于人类细胞中的其他SSAP，RecT具有更高的编辑活性，而没有编辑仅用dCas9或非靶向对照观察到上述背景（图4）。作者使用成像、凝胶电泳和测序验证了将SSAP与dCas9偶联能够进行基因敲入编辑。

西安齐岳生物可提供的基因敲入服务包括：

HiBiT定点敲入

基因敲入细胞定制服务

安全位点基因敲入

哺乳动物细胞基因敲入

ESC或iPSC干细胞基因敲入

荧光/蛋白标签定点敲入

CRISPR/CAS9介导基因敲入

基因敲入单克细胞一株

Tag标签敲入（无痕敲入）

报告基因敲入

基于puro标记筛选的safe harbor位点基因敲入（标记筛选）

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除