基因敲除敲入质粒的选择策略，基因编辑

研究基因功能的策略之一是用实验室设计的一段DNA替换或破坏基因，使其失活或"敲除"。特殊构建的质粒可以通过同源重组的方式替换酵母、小鼠或果蝇中的基因。其原理很简单：将带有目标序列的修复模板递送到细胞中，细胞将模板与内源基因重组。在这里，我们将讨论用于使哺乳动物细胞中特定基因失活的技术和质粒。尽管基于CRISPR的敲除/敲入系统很受欢迎，但同源重组这个系统仍然很有价值，特别是在CRISPR无法使用的情况下(例如附近没有合适的PAM序列,或者你感兴趣的基因很难用gRNA进行特异性靶向)。

敲除质粒

   同源重组是一种修复有害的双链断裂的机制，其中核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分子之间进行交换。基因靶向利用了这一自然过程，使用特殊设计的含有同源序列的载体，用同源序列替换目标基因位点。为了更了解一个过程，我们将介绍一个旨在敲除给定基因的2号外显子的实验。

敲除/敲入质粒  

基因打靶的方法也使得在基因组中插入或敲入任何基因、标签或突变的外显子成为可能。为此，将待插入的序列与阳性选择标记一起克隆到载体的同源序列之间。为了既能敲除特定基因，又能将GFP插入到基因组中，我们将以构建下图的质粒为例，将GFP的序列与新霉素抗性(Neomycin resistance，NeoR)基因一起克隆到目的基因外显子1和3之间。重组后，GFP / NeoR被插入到外显子2的位置。因此，目的基因被破坏(敲除)，但插入的GFP被表达(敲入)。如上面的例子所示，可以使用Cre重组酶去除抗性基因。因为GFP受到内源启动子的控制，所以可以使用GFP表达来跟踪参与发育的细胞或被该启动子响应的其他生理病理事件。也可以用这种方法用GFP标记内源蛋白。

敲除质粒的未来

   尽管这些方法已经被用于构建许多敲除细胞系和动物模型，但它们的效率很低，从无法检测到到0.1 %不等。相比之下，新的基因组编辑技术如CRISPR更容易使用，并且在敲除基因方面效率更高。CRISPR可以靶向一个基因组序列，创造一个可以通过使用修复模板进行同源重组修复的断裂。这些模板可以包括可条件性敲除等位基因的loxP位点。虽然CRISPR非常适合基因敲除，但是在大片段DNA中敲除依然十分困难。          

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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