基因敲入鼠的的原理与构建

齐岳生物生物提供基因敲入细胞定制服务，荧光蛋白定点敲入、蛋白标签定点敲入、基因敲入等均可实现。我们提供其定制服务，包括多种类型的细胞基因KI和全流程的服务支持。

基因敲入鼠的的原理

基因敲入是基于基因重组原理，将外源基因插入生命体基因组中，并使其在体内表达的技术。基因敲入一般有两种形式：

① 定点敲入：通过插入特定启动子位点来表达外源基因

在小鼠基因组的安全位点插入一段表达蛋白质所需要的完整DNA序列单元：包含特定启动子，需要过表达基因的CDS区以及polyA结构来实现过表达某种蛋白质。该位点一般能保证插入基因的正常表达，且对小鼠也无副作用。例如ROSA26位点就是一个非常成熟的位点，引物、同源臂的设计都得到验证。

② 原位敲入：在原基因敲除的位点插入新的基因

利用小鼠自身的启动子，在原基因敲除的位点插入新的基因CDS区，一般为引入报告基因以观察启动子表达情况，如GFP。也用于点突变鼠的构建。

下面我们分别介绍一下两种基因敲入鼠的设计和构建

（一）ROSA26位点定敲入鼠的构建

关于ROSA26位点

ROSA26位点位于小鼠基因组第6号染色体上，表达四个非编码的转录本。研究证实，这个位点的基因敲入对细胞及小鼠的健康无副作用，并能保证转入基因的正常稳定表达。该位点的两个等位区都带有外源插入片段的纯合子小鼠幼崽出生率略低于杂合子幼崽，但是也能正常发育并繁殖。结构图如下所示：

定点敲入的设计与构建

①首先需要一种基因编辑技术将ROSA26位点切开，方便该位点进行同源重组，如CRISPR/Cas9技术。由此，需要设计剪切ROSA26位点的CRISPR/Cas9系统向导RNA；

②另一方面，设计插入基因A，并在基因A两侧设计ROAS26位点的同源臂；

③将该同源重组供体（Donor）与CRISPR/Cas9相关RNA一同注射入小鼠受精卵中，利用CRISPR/Cas9在ROSA26位点形成DNA双链断裂，再利用同源重组将外源基因整合入ROSA26位点。

基因敲入小鼠的其余构建过程与基因敲除类似经过gRNA设计和筛选，sgRNA表达载体构建，显微注射，胚胎移植，小鼠培育及繁殖及小鼠基因型鉴定等过程。不同的是，需要额外设计插入片段，即整合入ROSA26位点的片段。

点突变的原位点敲入鼠构建

基于基因敲入技术的点突变鼠是也通过类似基因敲除的手段切割该段基因，随后利用同源重组原理，将经过点突变的片段整合入原基因组位点来构建的。若以CRISPR/Cas9基因编辑技术切割基因，需要设计该段基因的CRISPR/Cas9剪切向导RNA，以及经过点突变的基因片段，用以整合入基因组。随后将这些片段通过显微注射的方式打入小鼠受精卵，等待胚胎发育，经过鉴定幼崽即可得到想要的点突变鼠。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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