高通量突变体库的构建方法

DPNⅠ酶消化原理：DPN1 是一种限制性核酸内切酶，能够特异性切除甲基化的 DNA 链。定点突变后，我们需要区分并去除原始 DNA（未突变模板）。模版质粒来源于大肠杆菌，是经 dam 甲基化修饰的， DpnⅠ识别甲基化的 GATC 中的 A，而 GATC 在几乎各种质粒中都会出现，且不止一次，因而模板链对 DpnI 敏感而被切碎；而体外合成的带突变序列的质粒来源于 PCR 没有被甲基化，不能被 DpnⅠ识别剪切，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

1、将需要进行突变目的基因构建与质粒载体；

2、通过突变引物将突变位点引入目的基因；

3、通过突变引物PCR扩增整个质粒，将突变位点引入目的基因；

4、通过甲基化敏感核酸酶（Dpn1）去除模版质粒（通常质粒通过工程菌扩增，质粒上的胞嘧啶会产生甲基化，而体外扩增的质粒不会甲基化）；

5、测序验证突变情况；

实验操作       

 本操作方法描述了为三类突变（位点饱和突变、磷酸化位点特异性突变和自定义扫描突变）创建阵列突变体库的步骤。我们阐述了在为大肠杆菌中蛋白质表达设计的DNA构建体中一次性创建多达96个突变的时间安排。重要的是，该流程适用于细菌和哺乳动物表达系统中构建体的突变，并且可以根据个别研究者的需求增加或减少突变数量。

定制服务

高通量DNA突变库构建服务

哺乳动物表达载体构建

病毒载体构建（慢病毒、腺病毒、AAV）

报告基因载体构建

基因突变载体构建服务

miRNA、lncRNA表达载体构建

Crispr/Cas9 基因编辑慢病毒包装

腺病毒包装技术服务

细胞实验技术服务

shRNA真核表达载体构建

gRNA载体（单gRNA）构建

gRNA载体（双gRNA）构建

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除