利用CRISPR-Cas系统建立基因突变体库

利用CRISPR-Cas系统建立的突变体库也逐渐应用于正向遗传学筛选，其主要优势在于靶向特异的单个基因或多个基因，因而易于鉴定筛选，同时仅用数量较少的群体材料即可达到饱和突变。CRISPR-Cas系统能产生丰富的突变类型，包括插入、缺失、单碱基替换甚至基因组结构变异等，这是其他系统无法实现的。

图 CRISPR-Cas基因组编辑工具。

（A）Cas9-gRNA复合物靶向基因组特异性位点后进行切割，DNA修复后可以在靶位点产生核苷酸的缺失或插入。

（B）单碱基编辑器是通过融合Cas9（D10A）（nCas9）或Cas9（D10A H840A）（dCas9）到胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶上来构建的。胞嘧啶编辑器（CBE）实现C到T的转换，而腺嘌呤编辑器（ABE）实现A到G的转换。

（C）CRISPR干扰（CRISPRi）或CRISPR激活（CRISPRa），dCas9与转录抑制因子或激活结构域融合以调节RNA水平 (Gaillochet, Develtere et al. 2020)。

使用CRISPR技术创建突变体库的步骤如下图，每个步骤都有一些实验参数需要在正式实验前就确定好，比如：使用CRISPR-Cas的哪一种编辑系统？如何进行转化/转染？本实验室是否有足够的资源独立完成载体构建、转化、检测等工作？如果是想靶向特定的调控路径或数量性状，如何选择靶标？如何进行突变体的鉴定？对这些问题的考虑至关重要，否则可能出现无法快速省力地进行鉴定、没有足够的人员进行后期管理等情况。相比于动物细胞培养物，在植物中创建突变体库需要耗费更多的人力、物力对突变体材料进行管理

图 使用CRISPR技术创建突变体库的流程：设计gRNA文库、构建载体、进行遗传转化、检测靶位点 (Gaillochet, Develtere et al. 2020)。

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

定制服务

基因过表达细胞稳转株构建

基因敲入细胞稳转株构建（插入片段<3 kb）

点突变细胞稳转株构建

基因敲除细胞稳转株构建（移码突变）

基因敲除细胞稳转株构建（缺失突变）

基因敲低细胞稳转株构建

基因敲入细胞稳转株

Tet诱导基因表达细胞稳转株构建

质粒基因递送的脂质纳米颗粒（LNP）

shRNA基因敲低稳转株构建

文库质粒克隆（包括oligo合成和NGS验证）

CRISPR文库质粒构建

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

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