过表达质粒转染的原理和步骤-UDP糖丨MOF丨金属有机框架丨聚集诱导发光丨荧光标记推荐西安齐岳生物

订单热线

400-6966-012

您当前所在位置：首页 > 资讯信息 > 新品上市

产品分类

过表达质粒转染的原理和步骤

发布时间：2024-12-17 作者：axc 分享到：

过表达质粒转染的原理和步骤

质粒是含有外源基因的小型环状DNA分子，可在宿主细胞中复制、表达特定基因。质粒构建的过程需要考虑多方面的因素，包括载体的选择、插入片段的设计、连接与转化、阳性克隆的筛选等。

以人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 细胞株为例：

(1) 用 25 cm2 细胞透气培养瓶，含有 10% 胎牛血清和 1% 青链霉素的 DMEM 完全培养基培养 SH-SY5Y 细胞 (培养条件为：37 ℃、5% CO2)。

(2) 每 1～2 天进行换液，细胞长至 80 %～90 % 时传代：

① 用吸管吸出旧的培养基，PBS 清洗 2 次，每次 5 mL，每瓶加入 0.5 mL 胰酶，消化 30～60s。显微镜下观察大部分细胞收缩、变圆，有少许细胞开始掉落时，立即用吸管吸出胰酶，加入 5 mL 培养基吹打终止消化，使细胞从瓶壁上全部脱落，悬浮在培养基中。

② 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，4 ℃，1000 rpm，离心 5 min。

③ 弃上清，新鲜培养液重悬细胞并轻轻混匀，根据细胞生长密度选择传代瓶数。一周传代 2～3 次。

(3) 细胞冻存时，冻存液成分：70% 培养基，20% 胎牛血清，10% DMSO；冻存密度为 1～2×106 个 /管，液氮保存。

过表达质粒转染的原理和步骤

分组

(1) 正常对照组 (C)：正常培养 SH-SY5Y 细胞。

(2) 阴性对照组 (NC)：SH-SY5Y 细胞转染阴性对照质粒。

(3) 过表达组 (PC)：SH-SY5Y 细胞转染过表达质粒。

转染

细胞铺板 24 h 后，按照 Lipofectamine 说明书用其进行转染。转染 48 h 后，荧光显微镜下观察其 GFP 的表达情况及统计其转染效率 (对明场及暗场荧光细胞计数，得：转染效率 = 暗场荧光细胞个数 / 明场细胞个数；也可通过流式等观察统计其转染情况)。

结果显示，阴性对照组和 Parkin 过表达组细胞内可观察到较多的绿色荧光蛋白表达，而正常组细胞没有观察到，则质粒成功转染至细胞内。

过表达质粒转染的原理和步骤

齐岳生物生物提供的基因敲入细胞定制服务，包括荧光蛋白定点敲入、蛋白标签定点敲入、基因敲入等。通过核转染法将 CRISPR/Cas9 系统的 gRNA 载体（含 Cas9）与携带目的片段的 Donor 共转入细胞中，在 gRNA 和 Cas9 复合物造成靶位点 DNA 双链断裂后，细胞以 Donor 作为模板进行同源重组修复（HDR）实现目的片段的定点敲入。客户可以根据自己的需求选择不同的服务类型。

哺乳动物嵌合抗原受体（CAR）表达载体

哺乳动物抗体轻链表达载体 PiggyBac转座载体

哺乳动物抗体表达载体 PiggyBac转座载体

哺乳动物抗体表达载体 Tol2转座载体

shRNA打靶效率检测载体

shRNA打靶效率检测载体慢病毒载体（表达含打靶位点的报告基因）

shRNA打靶效率检测载体慢病毒载体（表达shRNA和含有打靶位点的报告基因）

哺乳动物CRISPR基因编辑载体

gRNA和Cas9共表达载体质粒载体

gRNA和Cas9共表达载体慢病毒载体

gRNA和Cas9共表达载体腺病毒载体

gRNA和Cas9共表达载体 AAV病毒载体（表达单SagRNA）