LAG3慢病毒质粒构建,转染细胞系的建立

LAG3的主要配体为主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(majorhistocompatibilitycomplexll,MHCll)。肿瘤细胞表面表达的LAG3配体分子与其结合，抑制T淋巴细胞激活，发挥负向免疫调节功能。WANG等研究显示:纤维蛋白样蛋白1(fibrinogen-likeprotein1,FGL1)是MHCⅡI之外的LAG3的另一个配体。

LAG3慢病毒质粒的构建

将pEZ-mCherry载体与pcDNA3.1-LAG3质粒同时用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，37℃水浴4h，酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并对相关片段进行凝胶回收，采用T4DNA快速连接酶在25℃水浴连接1h，将连接产物转化到DH5α感受态细胞，接种至含氨苄青霉素(Amp)的LB平板培养基中，过夜培养。从平板培养基中挑取单个菌落﹐160r-min-'摇床过夜，提取质粒。双酶切验证成功的质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

LAG3稳定特染细胞系的建立

LAG3稳定转染细胞系通过脂质体转染及嘌呤霉素筛选获得。转染前1d，将对数生长期的HEK293T细胞以每孔1×10°个细胞的密度接种在6孔细胞培养板中，转染前汇合度达到70%~90%。第2天加入含有Lipofectamine3000及LAG3质粒的Opti-MEM混合溶液，以转染空载体PEZ-mCherry为对照，4h后换成新鲜配制的完全培养基，转染48h后在荧光显微镜下587nm激发光观察细胞膜上和细胞质中LAG3-mCherry红色荧光的表达及细胞膜定位情况。为了获得稳定表达LAG3的HEK293T细胞系，转染48h后将细胞转移至10cm培养皿进行培养，更换为含嘌呤霉素(8mg-L-')的新鲜培养基，每隔2d弃去原有培养基，用PBS缓冲液清洗2次，更换含嘌呤霉素(8mg·L-1)的新鲜培养基，此步骤重复3次。在筛选细胞的细胞膜上检测到明亮的红色荧光提示稳定转染细胞初步制备成功。

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服务

pcDNA3.1-cathepsin B质粒

pSilencer2.1-cathepsin B质粒

人RNF20基因过表达质粒

过表达Abba1重组表达质粒

Ifi47的过表达质粒

多肽P18(SAP18)过表达质粒

miR-122过表达质粒载体

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SNCA基因过表达慢病毒质粒构建

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哺乳动物基因表达载体 质粒载体

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