文献：Ratiometric fluorescence imaging of cell surface pH by poly(ethylene glycol)-phospholipid conjugated with fluorescein isothiocyanate

作者：Ryuichi Ohgaki, Yuji Teramura, Daichi Hayashi, Lili Quan, Suguru Okuda, Shushi Nagamori, Madoka Takai & Yoshikatsu Kanai

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41598-017-17459-y

摘要：

为了优化成像分析的条件，我们接下来检查了用FITC-PEG脂质标记细胞表面的时间过程。将人胃印戒细胞癌KATO III细胞与FITC-PEG脂质孵育0、1、5、10、20、30和60分钟 min，并进行共聚焦激光扫描显微镜观察。

FITC-PEG脂质的荧光仅在质膜上检测到。至少在60℃以下没有观察到荧光显著内化到细胞质中 这与之前使用其他细胞系报道的FITC-PEG脂质的细胞表面保留特性一致。根据每个孵育时间获得的图像，计算每个细胞的平均荧光强度，并绘制孵育时间图。

KATO III细胞表面FITC-PEG脂质的荧光强度在30 min。因此，FITC-PEG脂质标记的孵育时间固定为30 在接下来的所有实验中。已证实，在这种情况下，用FITC-PEG脂质孵育不会显著影响KATO III细胞的存活率。

为了进一步证实FITC-PEG脂质在细胞外表面的保留，在KATO III细胞中表达了mem mCherry（Lyn激酶N端肽和红色荧光mCherry的融合蛋白）。Lyn激酶的N-末端序列接受脂肪酰化，这对于将蛋白质锚定在质膜的内小叶是必要和充分的23。

FITC-PEG脂质和mem mCherry都位于质膜上。更高放大倍数的观察和跨质膜的峰值检测表明，FITC-PEG脂质和mem mCherry的荧光信号大多重叠，但与mem mChurry相比，FITC-PEG-脂质的荧光峰值略微向外部偏移。

当mem-AcGFP（Lyn激酶N端肽和绿色荧光AcGFP的融合蛋白）与mem-mCherry共表达时，没有观察到荧光峰的这种变化（图3d，e）。这些结果进一步支持FITC-PEG脂质保留在KATO III细胞的细胞外表面。

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