Cyanine5-PEG-Hemoglobin，CY5-聚乙二醇-甲状腺球蛋白的合成流程概述

CY5-PEG-Hemoglobin 为将近红外荧光团 Cy5 通过聚乙二醇（PEG）作为柔性连桥共价偶联至血红蛋白（Hb）表面的功能化产物，目标是在保留血红蛋白四聚体构象与氧结合功能的同时赋予可追踪荧光信号。其总体结构可表述为：Hb（四聚体蛋白核心）—（蛋白表面赖氨酸/半胱氨酸残基）—接合位点—PEG（可控链长）—Cy5（荧光末端）。PEG 常选线性 PEG（分子量 500–5000 Da）以调节亲水性与空间位阻，末端一侧带与蛋白反应的活性基团（NHS 酯用于胺；maleimide 用于巯基），另一端为已活化或已接入的 Cy5（如 Cy5-NHS、Cy5-maleimide 或 Cy5-DBCO）。

典型结构合成流程概述：

试剂与链接臂设计：选定 PEG 长度并制备或购置 Cy5-PEG-X（X = NHS 或 maleimide）；若无现成试剂，可先合成 PEG-NH2，然后与 Cy5-NHS 偶联制得 Cy5-PEG-NH2，再将另一端活化为 NHS 或 maleimide。

蛋白预处理：从商业 Hb 或血液提取物纯化后用缓冲（PBS pH7.2，去除胺类缓冲如 Tris）透析或凝胶过滤，测定蛋白浓度并评估构象（UV280、CD）与功能基线（氧解离曲线或亚硝酸还原敏感性）。

偶联反应：若用 NHS-活化体系，在 pH 7.2–7.8 下将 Cy5-PEG-NHS 按目标染料/蛋白摩尔比（常 1–5:1 或更高，视所需标记度 DOL）加入 Hb 溶液，低温避光反应 30 min–2 h；若针对半胱氨酸，先将可用巯基轻度还原（TCEP 微量），再于 pH 6.5–7.0 下用 maleimide-PEG-Cy5 进行偶联。控制反应当量与时间以避免过度标记导致构象/功能丧失。

终止与纯化：用甘氨酸或 Tris 终止游离 NHS 酯反应；采用超滤（Amicon，MWCO ~30 kDa）或凝胶过滤（Sephadex G-25/G-50 或 Superdex 200）去除游离 Cy5-PEG 与小分子副产物，并在适当缓冲中浓缩。

表征与功能评估：测定标记度（DOL）—通过吸收光谱（λmax Cy5 ~650 nm 与蛋白 280 nm）计算；SDS-PAGE（荧光扫描 + 染色）检验共价结合与聚集；SEC / DLS 评估聚集或四聚体稳定性；若关注功能，测定 Hb 的氧结合曲线或过氧化物还原能力，比较标记前后活性保留率。MS（若可行）和 CD 光谱可用于进一步验证修饰与二级结构完整性。

保存与使用建议：低温避光、含剂或蔗糖/甘油的稳定缓冲短期 4°C 长期 -20°C 冻存，记录 DOL 与浓度以便生物学应用时准确稀释。

注意事项与优化点：选择短链 PEG 可减少对活性位点的屏蔽，但可能增加非特异吸附；长链 PEG 有利于提高溶解性与减少免疫识别但可能影响四聚体间相互作用。优先以低标记度（DOL 1–2）开始，评估功能保留后再按需提高。整个合成过程应全程避光、低温并尽量在去除游离胺/巯基干扰的缓冲体系中进行，以保证 Cy5 光学性质与 Hb 构象稳定。

产品名称：Cyanine5-PEG-Hemoglobin，CY5-聚乙二醇-甲状腺球蛋白

纯度：95%+

性状：固体或液体

储藏条件：-20°C干燥避光保存

包装规格：50mg  100mg  250mg  500mg（按需提供）

厂家：齐岳生物

关于我们

齐岳生物供应近红外荧光花菁染料标记各种官能团的定制服务，如活性酯（NHS酯）、马来酰亚胺（MAL）、叠氮（N₃）、炔基（alkyne）等，便于与蛋白质、肽、多糖、抗体、寡核苷酸、纳米颗粒等共价偶联。可选择多种功能团与目标分子进行精准结合，实现对蛋白质、多肽、抗体、核酸或纳米材料的荧光修饰。此外，齐岳生物还提供定制染料标记服务，包括肽类、蛋白类、小分子、糖类等不同类型标的物，满足用户在科研、成像等多方面的个性化应用。

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