FITC-D-Galactosamine Hydrochloride,异硫氰酸荧光素标记D-半乳糖胺盐酸盐的反应机理
异硫氰酸荧光素标记 D-半乳糖胺盐酸盐(FITC-D-Galactosamine Hydrochloride)是一类荧光化糖分子探针,其基本结构由两部分组成:一是具有强绿色荧光发射的异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC),二是带有氨基修饰的单糖 D-半乳糖胺的盐酸盐形式。D-半乳糖胺盐酸盐(Galactosamine·HCl)是 D-半乳糖的氨基取代衍生物,C-2 位羟基被氨基取代后形成特征性的氨基糖,进一步与盐酸结合形成稳定的盐酸盐,提高了水溶性和反应稳定性。FITC 则在分子末端含有活性异硫氰酸基(–N=C=S),能与伯胺或仲胺基团发生共价反应,形成稳定的硫脲(thiourea)键。这一反应特性使得 FITC 可以高效标记含氨基的生物分子,包括蛋白质、多肽以及氨基化糖类。将 FITC 偶联至 D-半乳糖胺盐酸盐,既保留了糖分子识别与亲水性特点,又赋予其荧光特性,成为糖化学和糖生物学研究中的常用探针。
一、结构特征与化学背景
FITC-D-Galactosamine·HCl 的核心在于异硫氰酸基与糖分子氨基之间的共价结合。FITC 部分由黄酮骨架及其苯环上的取代基构成,具有较强的吸收和发射光谱特征(激发波长约 490 nm,发射波长约 520 nm),常被用作绿色荧光标记。D-半乳糖胺分子则为一个典型的六碳氨基糖,保留了羟基取代的多位点特性,具备高度亲水性和与生物体系相容的特征。氨基位点在盐酸盐形式下呈质子化状态,但在适宜碱性条件下可以解离为游离氨基,从而为 FITC 的异硫氰酸基提供反应活性位点。
二、FITC 与 D-半乳糖胺盐酸盐的偶联反应机理
该反应机理可分为以下几个阶段:
氨基解离与活化
在反应开始阶段,D-半乳糖胺盐酸盐溶解于水或 DMSO 等溶剂中,在弱碱性缓冲液(如碳酸氢钠缓冲液,pH 8.0–9.0)条件下,盐酸盐形式的 –NH3⁺ 被去质子化,转化为可进攻的游离氨基(–NH2)。此步骤是反应成功进行的关键,因为 FITC 的异硫氰酸基对中性或质子化的氨基几乎不具备反应性。
亲核攻击
氨基作为亲核试剂对 FITC 的异硫氰酸基碳原子(–N=C=S 中的碳)发起亲核攻击,碳原子由于连接两个电负性原子(氮和硫),电子云分布不均,表现出亲电性。此时氨基中的孤对电子进攻异硫氰酸基的碳原子,形成中间体。
硫脲键形成
中间体经过质子转移和电子重新分布,终形成稳定的硫脲(–NH–C(=S)–NH–)键。这个键的化学稳定性较高,能有效抵抗水解,因此 FITC 与半乳糖胺之间形成了稳定的共价连接。这种硫脲连接方式是 FITC 荧光探针标记氨基类分子的典型反应模式。
副反应与优化
FITC 分子本身含有两个等位异构体(5-FITC 与 6-FITC),它们在苯环上的位置不同,因此在实际反应中可能产生混合标记物。为提高反应效率和标记均一性,通常需要严格控制 pH、温度和反应时间,避免过量的 FITC 发生自缩合或非特异反应。同时,反应完成后常采用透析、凝胶过滤或高效液相色谱(HPLC)进行纯化,以去除未反应的 FITC 或副产物。
三、反应条件对机理的影响
pH 值:过低的 pH 会使氨基质子化,导致亲核性降低;过高的 pH 会造成 FITC 异硫氰酸基的降解。因此佳范围在 8.0–9.0。
溶剂体系:常使用少量 DMSO 或 DMF 溶解 FITC,再与水相缓冲液混合,以保证 FITC 的溶解性和反应活性。
温度控制:室温(20–25℃)下反应较为温和,有利于生成稳定的产物;过高温度会加速 FITC 降解。
摩尔比:通常 FITC 与糖胺摩尔比控制在 1:1 至 2:1 之间,以保证反应完全并减少未反应物残留。
四、机理意义与化学应用启示
该反应机理揭示了 FITC 与氨基分子高效结合的分子基础,说明通过弱碱性条件激活氨基、利用异硫氰酸基的亲电性,可以快速获得稳定的荧光标记物。这一机理不仅适用于单糖氨基衍生物,还适用于氨基化的多糖、肽类、蛋白质等体系,因此在糖化学、糖组学、糖-蛋白相互作用研究中具有应用价值。
产品名称:FITC-D-Galactosamine Hydrochloride
纯度:95%+
性状:固体或液体
储藏条件:-20°C干燥避光保存
包装规格:50mg 100mg 250mg 500mg(按需提供)
厂家:齐岳生物
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