FITC-Lactate dehydrogenase，异硫氰酸荧光素标记乳酸脱氢酶的合成步骤概述

FITC-Lactate Dehydrogenase（FITC-LDH）是通过异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）与乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）蛋白共价偶联形成的荧光标记酶。乳酸脱氢酶为四聚体蛋白酶，单体分子量约36 kDa，具有 NADH/NAD⁺ 依赖的催化活性，可催化乳酸与丙酮酸之间的可逆转化。通过 FITC 偶联，LDH 获得绿色荧光信号（激发约495 nm，发射约520 nm），适用于分子示踪、酶动力学研究及蛋白相互作用分析，同时尽量保留其酶学活性。

1. 反应原理与偶联机制

FITC-LDH 的合成基于 FITC 异硫氰酸基（–N=C=S）与蛋白氨基的共价反应原理：

• LDH 表面含有赖氨酸残基和 N 端伯胺，作为亲核位点。

• 异硫氰酸碳原子受伯胺亲核攻击，形成稳定的氨基异硫氰酸酯键（thiourea）。

• 偶联反应在轻碱性缓冲液中进行（通常 pH 8–9），温和条件下保持蛋白的空间构象和活性位点完整。

• 通过控制 FITC 与 LDH 的摩尔比及反应时间，可以调节偶联密度，兼顾荧光强度与酶活性。

2. 合成步骤概述

1. 蛋白质溶液制备

• 选择高纯度 LDH 蛋白（可来源于牛心或重组表达体系）。

• 溶解于适当缓冲液（如碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH 8.0–8.5），确保蛋白浓度适中（一般 1–5 mg/mL）。

• 缓冲液中可加入少量盐以维持蛋白构象稳定，同时避免极端离子强度导致聚集。

2. FITC 溶液准备

• FITC 通常溶解于干燥的 DMSO 或乙醇中，形成高浓度储备液（约1–10 mg/mL）。

• 避免光照和潮湿环境，防止荧光团氧化或水解。

3. 偶联反应

• 将 FITC 储备液缓慢加入 LDH 蛋白溶液中，通常 FITC/蛋白摩尔比为1:1至5:1，可根据实验需求优化。

• 在轻碱性条件下（pH 8–9），室温或略低温（20–25°C）反应 2–6 小时。

• 轻柔搅拌，避免气泡或强力振荡，保证蛋白折叠稳定性。

4. 终止反应与初步处理

• 偶联反应完成后，可用适当缓冲液稀释体系，并通过 pH 调节或加入小分子胺（如甘氨酸）封闭未反应的 FITC 异硫氰酸基。

• 此步骤避免游离 FITC 对后续实验产生干扰，同时保持蛋白功能。

5. 纯化与去除游离 FITC

• 透析：使用分子量截断膜（MWCO 10–30 kDa）去除游离 FITC 和小分子副产物。

• 凝胶过滤（GFC）：通过分子筛柱分离 FITC-LDH 与低分子量物质。

• 高效液相色谱（HPLC）：可在需要高纯度产物的情况下使用反相或亲水相柱分离。

• 常用方法包括：

• 纯化完成后，收集 FITC-LDH 并缓慢浓缩，储存在缓冲液中，低温避光保存。

产品名称：FITC-Lactate Dehydrogenase

纯度：95%+

性状：固体或液体

储藏条件：-20°C干燥避光保存

包装规格：50mg  100mg  250mg  500mg（按需提供）

厂家：齐岳生物

关于我们

齐岳生物供应近红外荧光花菁染料标记各种官能团的定制服务，如活性酯（NHS酯）、马来酰亚胺（MAL）、叠氮（N₃）、炔基（alkyne）等，便于与蛋白质、肽、多糖、抗体、寡核苷酸、纳米颗粒等共价偶联。可选择多种功能团与目标分子进行精准结合，实现对蛋白质、多肽、抗体、核酸或纳米材料的荧光修饰。此外，齐岳生物还提供定制染料标记服务，包括肽类、蛋白类、小分子、糖类等不同类型标的物，满足用户在科研、成像等多方面的个性化应用。

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