FITC-氨苄青霉素钠，异硫氰酸-氨苄青霉素钠的反应机理

FITC（荧光素异硫氰酸酯，Fluorescein isothiocyanate）是一类含异硫氰酸基（–N=C=S）的荧光标记试剂，能与一级或二级胺发生亲核加成，生成稳定的硫脲（thiourea）键。氨苄青霉素（ampicillin）为含有侧链 —CH(NH₂)-COO- 的β-内酰胺类广谱半合成青霉素，其侧链上的原子在偶联反应中可作为亲核位点（α-胺）。将 FITC 与氨苄青霉素偶联可制得带荧光的抗生素探针（FITC-ampicillin），用于研究细胞壁结合、细菌摄取、抗生素定位与示踪等生物/药学研究。需要注意的是 β-内酰胺环对碱和水解敏感，合成条件必须温和、短时间、低碱性以避免环裂解导致失活。

合成原理与反应机理

FITC 的异硫氰酸基与氨苄青霉素侧链上的 α-初级胺发生亲核加成，形成硫脲连接 —NH-C(=S)-NH—，该键稳定且荧光团通过共轭结构提供示踪信号。反应一般在弱碱性缓冲（pH 8.0–9.0）进行，以确保胺为游离碱性形态提高亲核性，但又不能过强碱性以免开环水解β-内酰胺。

典型合成步骤（操作要点，非实验配方）

底物准备

取高纯度氨苄青霉素钠（或氨苄青霉素游离酸并中和为钠盐）溶于适量的缓冲水溶液（常用碳酸氢钠缓冲或碳酸盐缓冲，pH 8.0–8.5），保持低温（0–4°C）以减缓水解。

FITC 通常以 FITC-isomer mixture 或单一异构体购入，先在干燥的有机溶剂（DMSO、DMF）中制成浓溶液，避光处理（荧光素对光敏感）。

偶联反应

将 FITC 溶液在搅拌下缓慢加入氨苄青霉素溶液，控制反应体系pH在 8.0–8.5（略碱性）。

反应在4°C或室温短时间进行（通常数小时内），并避光操作以保护荧光团。

若需提高单一位点选择性，可限制 FITC 当量（轻微过量或等摩尔）并缩短反应时间。

终止与粗分离

用缓冲液或轻酸化（例如pH 6.5）使未反应的胺质子化并终止反应；或直接通过透析/凝胶过滤去除小分子FITC与溶剂残余。

采用凝胶过滤（如 Sephadex G-10/G-25）或反相固相萃取（SPE）初步分离大分子（标签化氨苄）与游离FITC。

纯化

制备级反相HPLC（C18）是推荐方法：用梯度溶剂（水 + 0.1%TFA / ACN）分离 FITC-ampicillin 与副产物、未反应底物及游离FITC。

收集目标峰，浓缩并冻干得到 FITC-氨苄青霉素钠（或其可溶性盐）。

表征

质谱（ESI-MS）：确认加成产物分子量（氨苄 + FITC − H₂O / +相应离子形式）。

UV-Vis/荧光光谱：FITC 在约495 nm 激发，约519 nm 发射，测定荧光特性与标记度（标记摩尔比）。

¹H NMR（若可溶于有机相）：用于确认硫脲形成与其他结构完整性（注意：β-内酰胺在NMR中容易受溶剂影响）。

HPLC 分析：评估纯度与残留游离染料。

关键注意事项与工艺优化

避免β-内酰胺开环：保持反应短时、pH 温和（不超过约9），尽量低温进行；使用溶剂与缓冲体系使药物稳定。

光敏性保护：FITC 对光、氧敏感，整个制备与纯化过程应避光（用铝箔遮光）并可在惰性气氛下操作以降低氧化。

标记度控制：过高的染料装载可能影响抗生素的活性与细胞/细菌结合特性，需通过摩尔比与反应时间优化。

产品名称：FITC-氨苄青霉素钠

纯度：95%+

性状：固体或液体

储藏条件：-20°C干燥避光保存

包装规格：50mg  100mg  250mg  500mg（按需提供）

厂家：齐岳生物

关于我们

齐岳生物供应近红外荧光花菁染料标记各种官能团的定制服务，如活性酯（NHS酯）、马来酰亚胺（MAL）、叠氮（N₃）、炔基（alkyne）等，便于与蛋白质、肽、多糖、抗体、寡核苷酸、纳米颗粒等共价偶联。可选择多种功能团与目标分子进行精准结合，实现对蛋白质、多肽、抗体、核酸或纳米材料的荧光修饰。此外，齐岳生物还提供定制染料标记服务，包括肽类、蛋白类、小分子、糖类等不同类型标的物，满足用户在科研、成像等多方面的个性化应用。

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