Difluorocarboxyfluorescein NHS Ester, 6-isomer（CAS号2702251-82-7）是一种功能性荧光标记化合物，结合了二氟羧基荧光素（Difluorocarboxyfluorescein, DFCF）与活化羧基衍生物 N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS Ester），用于蛋白质、多肽及其他含氨基生物分子的共价标记。其合成步骤主要围绕羧基活化、NHS 偶联及纯化表征展开，以下为概述说明。

合成的第一步是选择性获得 6 位二氟羧基荧光素（DFCF-6-COOH）。该步骤通常通过羟基荧光素衍生物的二氟化反应和保护基策略实现，以保证最终产品的定位和官能团完整性。此过程中，使用适宜的溶剂体系（如 DMF 或 DMSO）和温和条件（室温至轻微加热）避免荧光团结构破坏，同时通过薄层色谱（TLC）或液相色谱监控反应进程，确保 6 位羧基得到优先修饰。

中文名称：Difluorocarboxyfluorescein NHS Ester, 6-isomer

MF： C25H13F2NO9

MW： 509.37

CAS： 2702251-82-7

第二步是羧基活化，核心反应是将 DFCF-6-COOH 转化为活性 NHS 酯。通过在羧基上引入 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和适当的脱水剂（如 DCC 或 EDC），在有机溶剂体系中进行反应，使羧基形成易于亲核进攻的活性酯。此步骤要求温和的反应条件（通常室温至 25–30°C），并避免水分进入，以防止 NHS 酯水解，同时保持荧光团的光学性质和化学稳定性。

第三步是偶联反应的优化与纯化。在生成 NHS 酯后，产物通常通过柱层析（如硅胶或反相 C18 柱）分离未反应的底物、脱水剂副产物及低分子杂质，获得纯净的 Difluorocarboxyfluorescein NHS Ester 6-isomer。反应溶剂一般为乙腈、二甲基甲酰胺或甲醇-水混合体系，纯化过程可通过溶剂梯度洗脱实现高纯度回收。纯化完成后，通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）及红外光谱（FTIR）进行结构确认和官能团验证，确保生成物的结构完整性和活性官能团保留。

第四步是储存和稳定性处理。Difluorocarboxyfluorescein NHS Ester 对水分敏感，易水解，通常在干燥、低温（–20°C）及避光条件下保存。为保证在后续蛋白质或多肽标记实验中的高效反应性，通常采用分装、真空干燥或在无水溶剂中冻干储存，以延长活性期并防止荧光团退色或失活。

整体合成过程中，关键点在于保证 6 位羧基选择性、NHS 酯高效生成及产物纯化的完整性。通过严格控制温度、溶剂体系和水分含量，可以最大化产物收率，同时保持荧光性质。最终生成的 Difluorocarboxyfluorescein NHS Ester 6-isomer 可在温和条件下与含氨基的生物分子反应，形成稳定酰胺键，实现高选择性、可控的荧光标记。

综上所述，Difluorocarboxyfluorescein NHS Ester 6-isomer 的合成步骤概述包括四个主要环节：首先选择性合成 6 位二氟羧基荧光素，接着通过 NHS 活化形成活性酯，随后进行纯化分离杂质和未反应底物，最后通过结构表征验证产物，并在干燥、低温、避光条件下储存。该合成策略保证了产物的高纯度、活性官能团完整性和荧光稳定性，为蛋白质、多肽及生物分子标记提供可靠试剂。