ICG NHS ester 与抗体的高效偶联工艺及偶联物稳定性研究

ICG（Indocyanine Green）是一种近红外（NIR, 780–820 nm）荧光染料，具有低自发荧光干扰、高组织穿透深度和良好的体内安全性。将 ICG 通过 NHS 酯形式与抗体进行共价偶联，可构建近红外成像抗体探针，在肿瘤术中导航、活体成像与抗体药物开发领域应用广泛。然而，ICG 易聚集、光稳定性较差、结构对 pH 敏感，因此偶联条件必须优化，以保证高偶联效率与产物稳定性。

1. ICG-NHS ester 偶联原理与关键参数
ICG-NHS ester 可与抗体中的赖氨酸（Lys）侧链伯胺发生酰胺键结合。影响偶联效率与抗体活性的主要因素包括：
（1）pH 条件：*佳反应 pH 为 8.3–8.6；pH 过高会导致抗体变性，pH 过低会降低 NHS 酯活性。
（2）摩尔比（Dye/Antibody Ratio, DAR）：通常 2–4 为合适范围；DAR 过高会影响抗体构象与亲和力，DAR 过低导致信号不足。
（3）溶剂体系：ICG-NHS 酯易溶于 DMSO，工作浓度不宜超过总体积的 10%，否则影响抗体稳定性。
（4）反应时间与温度：常温避光反应 1 h 即可完成，低温或过短可能导致效率下降。

2. 偶联工艺优化策略
（1）缓冲体系选择：使用无胺缓冲液（如 PBS、HEPES 或 0.1 M NaHCO₃）避免与 NHS 酯竞争反应。Tris 缓冲液禁止使用。
（2）抗体预处理：去除叠氮钠、甘油与胺类稳定剂，以免抑制偶联反应。常用方法包括超滤或凝胶过滤。
（3）DAR 定量与质量控制：通过 UV-Vis 光谱在 280 nm（抗体）与 780 nm（ICG）联合定量 DAR。若 DAR 偏高，可加入未标记抗体稀释；若偏低，则适当增加 ICG-NHS 量或延长反应时间。
（4）纯化方式：采用 Sephadex G-25 或 G-50 脱盐柱可快速去除游离染料；对高 DAR 类似物可进一步通过 SEC（体积排阻层析）提纯。

3. 偶联物稳定性优化与储存条件
ICG 偶联物的稳定性决定其成像表现与药代行为。主要影响因素包括光照、氧化、pH、温度及溶剂。
（1）光稳定性：ICG 对光敏感，需避光操作，成品储存于棕色瓶中。
（2）聚集抑制：可加入 0.01% Tween-20 或使用适当的蛋白稳定剂避免 ICG 在水溶液中聚集导致荧光猝灭。
（3）温度与冻存：短期 4°C 储存，长期应 -20°C 或 -80°C 冻存，并避免反复冻融。
（4）结构稳定性测试：可通过 SDS-PAGE、HPLC、DLS 测定抗体构象、聚集度及偶联后分子量变化。

4. 应用前景
高质量 ICG-抗体偶联物可用于：

肿瘤术中导航（如乳腺癌、肝癌、甲状腺癌）

活体荧光成像与药代动力学研究

靶向治疗药物的配体跟踪

多模态探针（如 ICG-AuNPs 或 ICG-放射同位素三模态成像）

随着偶联技术的标准化与光稳定性增强策略的发展，ICG-NHS ester 偶联平台有望支持更多抗体药物和外科成像领域的创新应用。