慢病毒介导的稳定细胞株构建流程
慢病毒载体(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,可高效的将目的基因导入各种细胞系,对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。慢病毒基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA,形成DNA整合前复合体,进入细胞核后,目的基因的DNA序列随机整合到细胞基因组中。整合后的DNA通过转录、翻译,可大量表达目的基因。利用载体中所含的抗性标志进行筛选,可得到目的基因稳定过表达的细胞株。
慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。
直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。无需任何转染试剂,操作简便。可以根据客户需要制备多种标记。
流程:
1、含有目的基因的慢病毒表达载体的构建和质粒纯化提取。
2、 慢病毒表达载体与包装系统共转染病毒包装细胞。
3、 收集病毒液。
4、 纯化和浓缩病毒。
5、 分装、- 80 oC保存。
6、 滴度测定及无菌检测。
定制服务:
点突变细胞构建
构建定点突变疾病模型
修复细胞基因中的突变
质粒点突变
点突变质粒
定点突变服务
单一突变服务
突变文库服务
哺乳动物细胞点突变
ESC或iPSC干细胞点突变
RNP法点突变
先导编辑点突变
单点、多点突变(替换、插入、删除或截断)或随机突变
西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括:
(1)过表达质粒构建;
(2)诱导基因的定点突变;(单碱基突变,多碱基突变)
(3)构建基因截短体质粒;
(4)亚克隆质粒构建;
(5)通过慢病毒介导的基因过表达;
(6)通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减
(7)通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除
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