基于CRISPR/Cas9的基因敲入（KI）

基因敲入是指将一个新的基因或DNA序列插入到基因组中的一个特定位置。可以通过同源重组、病毒载体或CRISPR/Cas9来实现。同源重组介导的基因敲入需要将一个包含所需基因序列的修饰DNA片段引入到目标位点；病毒载体，如逆转录病毒或腺相关病毒（AAVs），可以用来将新基因传递到基因组中；CRISPR/Cas9也可以通过使用供体DNA模板以及sgRNA和Cas9酶来插入一个基因。

原理：

当Cas9内切酶切割双链DNA时，同时提供一段与靶基因高度同源的DNA修复模板，生物体即可启动HDR修复路径。这段模板可以是单链DNA（ssDNA），也可以是双链DNA（dsDNA)，上面包含一段目的序列，其两侧序列与切口附近的基因组序列一致，因此可以作为同源臂将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点，从而实现精确的基因敲入。

步骤：

（1）分析敲入基因，确定靶位点进行sgRNA的设计；

（2）构建敲入载体:Cas9-sgRNA表达质粒、donor DNA;

（3）构建基因敲入细胞株：依据所要编辑的细胞选择Cas9、sgRNA和donor不同导入方式（脂质体、电转或病毒包装）；

（4）将抗生素素筛选后分离的细胞克隆进行测序验证；

（5）96孔板进一步筛选单克隆并测序，选择敲入纯合细胞株。

应用：

基因敲入技术可用于各种目的，除了在培养细胞中进行基因敲入外，还包括在动物模型中引入特定的遗传变异来研究其影响，补偿本地基因的丢失或故障，以及创造具有所需性状的转基因生物体。具体如下：

（1）CRISPR/Cas9基因片段敲入细胞系的建立；

（2）CRISPR/Cas9基因单碱基突变细胞系的建立；

（3）CRISPR/Cas9基因敲入动物疾病模型的建立。

服务：

哺乳动物细胞基因敲入

ESC或iPSC干细胞基因敲入

荧光/蛋白标签定点敲入

CRISPR/CAS9介导基因敲入

基因敲入单克细胞一株

Tag标签敲入（无痕敲入）

报告基因敲入

基于puro标记筛选的safe harbor位点基因敲入（标记筛选）

基因敲入小鼠

西安齐岳生物可提供的质粒构建服务包括：

（1）过表达质粒构建；

（2）诱导基因的定点突变；（单碱基突变，多碱基突变）

（3）构建基因截短体质粒；

（4）亚克隆质粒构建；

（5）通过慢病毒介导的基因过表达；

（6）通过构建shRNA慢病毒质粒实现基因的敲减

（7）通过CRISPR-Cas9技术实现基因敲除

注意事项：

本产品仅供科研使用，严禁用于人体或其他非科研用途。

使用过程中请佩戴手套和护目镜等防护用品，避免直接接触皮肤和眼睛。

请按照相关文献和相关安全规定进行操作，避免误用或滥用。如有侵权，可联系我们删除