DOTAP 阳离子脂质体的制备工艺优化及 siRNA 递送效率研究

一、研究背景与意义

RNA 干扰（RNAi）技术凭借其特异性强、基因沉默效率高的优势，已成为基因功能研究和疾病靶向治疗的核心技术之一。小干扰 RNA（siRNA）作为 RNAi 技术的核心效应分子，可通过靶向降解靶基因 mRNA 实现精准的基因表达调控。但 siRNA 自身存在易被血清核酸酶降解、亲水性强难以穿透细胞膜、体内半衰期短等缺陷，严重限制了其临床转化应用。因此，开发高效、安全的 siRNA 递送载体是突破 RNAi 技术应用瓶颈的关键。

阳离子脂质体因具备生物相容性好、可通过静电作用高效包载负电性 siRNA、制备工艺相对简便等特点，成为 siRNA 递送载体的主流选择。DOTAP（1,2 - 二油酰基 - 3 - 三甲基铵丙烷）是一种常用的阳离子脂质材料，其季铵盐头部的正电荷可与 siRNA 的磷酸基团形成稳定复合物，同时其疏水尾部可促进脂质体与细胞膜的融合，实现 siRNA 的胞内递送。但传统 DOTAP 阳离子脂质体制备工艺存在粒径分布不均、包封率波动大、递送效率不稳定等问题，且过高的阳离子比例易引发细胞毒性。基于此，本研究通过系统优化 DOTAP 阳离子脂质体的制备工艺，提升其 siRNA 包载能力与递送效率，同时降低细胞毒性，为 RNAi 技术的临床应用提供技术支撑。

二、实验材料与方法

（一）实验材料

DOTAP 脂质粉末、胆固醇（Chol）、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）；FAM 标记的 siRNA（FAM-siRNA）、靶向 EGFR 的 siRNA（EGFR-siRNA）及阴性对照 siRNA（NC-siRNA）；人肺癌 A549 细胞、人宫颈癌细胞 HeLa 购自中国科学院细胞库；DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶；CCK-8 试剂盒、RNA 提取试剂盒、实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）试剂盒；纳米粒度仪、Zeta 电位分析仪、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、qRT-PCR 仪为主要实验仪器。

（二）DOTAP 阳离子脂质体的制备

本研究采用薄膜分散 - 高压均质联用工艺制备脂质体，具体步骤如下：1）按不同比例称取 DOTAP、Chol、DOPE，溶于三氯甲烷 - 甲醇混合溶液（体积比 2:1），在旋转蒸发仪上减压旋蒸，形成均匀脂质薄膜；2）向旋蒸瓶中加入 PBS 缓冲液（pH=7.4），水化 30min 形成粗脂质体混悬液；3）将粗混悬液转移至高压均质机，设置不同均质压力与均质次数，制备粒径均一的脂质体；4）将制备的脂质体与 siRNA 按不同氮磷比（N/P，脂质体阳离子氮原子与 siRNA 磷酸基团摩尔比）室温孵育 20min，形成脂质体 - siRNA 复合物（lipoplexes）。

（三）制备工艺优化指标

以脂质体的平均粒径、多分散系数（PDI）、Zeta 电位、siRNA 包封率为核心优化指标，分别考察脂质比例（DOTAP:Chol:DOPE）、均质压力、均质次数、水相 pH 对脂质体性能的影响。其中，包封率采用荧光分光光度法测定，通过计算游离 siRNA 与总 siRNA 的荧光强度比值，确定脂质体对 siRNA 的包封效率。

（四）siRNA 递送效率与细胞毒性检测

1）细胞摄取效率：将 A549 细胞与 HeLa 细胞接种于共聚焦培养皿，加入不同 N/P 比的 FAM-siRNA-lipoplexes，孵育 4h 后，通过流式细胞术检测细胞平均荧光强度（MFI），激光共聚焦显微镜观察 siRNA 在细胞内的分布；2）基因沉默效率：将 EGFR-siRNA-lipoplexes 转染 A549 细胞，48h 后提取细胞总 RNA，通过 qRT-PCR 检测 EGFR mRNA 表达水平，同时采用 Western blot 检测 EGFR 蛋白表达量；3）细胞毒性：采用 CCK-8 试剂盒检测不同浓度脂质体对细胞存活率的影响，计算半数抑制浓度（IC50）。

三、实验结果与分析

（一）制备工艺的优化结果

1）脂质比例优化：当 DOTAP:Chol:DOPE 质量比为 1:1:1 时，脂质体综合性能*优，其平均粒径为 132±6nm，PDI 为 0.11±0.02，Zeta 电位为 + 31.5±1.8mV，siRNA 包封率达 92.7±1.2%。Chol 的加入可增强脂质体膜稳定性，DOPE 则能促进脂质体与细胞膜融合，三者比例失衡会导致包封率下降或粒径增大；2）均质工艺优化：均质压力 100MPa、均质次数 7 次时，脂质体粒径分布*均一，PDI＜0.15，且无明显脂质体聚集；压力过高（＞120MPa）会破坏脂质体膜结构，导致包封率降低；3）水相 pH 优化：中性 pH（7.4）环境下制备的脂质体电位*稳定，酸性或碱性环境会引发脂质材料水解，降低脂质体稳定性。*终确定*优制备工艺为：DOTAP:Chol:DOPE=1:1:1、均质压力 100MPa、均质次数 7 次、水相 pH=7.4。

（二）siRNA 递送效率评价

1）细胞摄取效率：当 N/P=5 时，A549 细胞与 HeLa 细胞对 FAM-siRNA 的摄取效率分别达 90.2±2.1% 与 88.7±1.8%，显著高于 N/P=3 组（66.5±2.5%、64.3±2.2%）；激光共聚焦成像显示，siRNA 主要分布于细胞质中，无明显核内富集，符合 RNAi 作用的亚细胞定位要求；2）基因沉默效率：EGFR-siRNA-lipoplexes 转染 A549 细胞 48h 后，EGFR mRNA 表达水平较空白组下降 78.5±3.2%，蛋白表达水平下降 72.3±2.8%，而 NC-siRNA 组无明显基因沉默效果，表明该脂质体可高效递送 siRNA 并实现特异性基因沉默。

（三）细胞毒性分析

*优工艺制备的脂质体在 N/P≤5 时，细胞存活率均＞85%，IC50 值为 32.6μg/mL，显著高于传统工艺制备的脂质体（IC50=18.7μg/mL）。当 N/P＞7 时，细胞存活率骤降至 60% 以下，提示过高的阳离子比例会引发细胞膜损伤，因此 N/P=5 为兼顾递送效率与细胞安全性的*佳比例。

四、讨论与应用前景

本研究采用薄膜分散 - 高压均质联用工艺，实现了 DOTAP 阳离子脂质体的精准制备，*优工艺下的脂质体具备粒径均一、包封率高、毒性低的优势，其 siRNA 递送效率与基因沉默效率均达到临床应用的基本要求。相较于传统单一制备工艺，联用工艺既保留了薄膜分散法的高包封率优势，又通过高压均质实现了粒径的精准调控，解决了传统脂质体粒径不均的问题。

在应用层面，该脂质体可作为通用型 siRNA 递送载体，用于肿瘤、病毒性疾病等的靶向治疗。例如，靶向 EGFR 的 siRNA 递送系统可用于非小细胞肺癌的精准治疗；同时，通过对脂质体表面进行 PEG 修饰或靶向配体偶联，可进一步提升其体内循环时间与肿瘤靶向性。但该载体仍存在体内靶向性不足、血清稳定性有限等缺陷，未来需通过表面功能化修饰进一步优化其体内递送性能。

五、结论

本研究通过系统优化 DOTAP 阳离子脂质体的制备工艺，成功获得了性能优良的 siRNA 递送载体。该载体在 N/P=5 时可实现 siRNA 的高效包载与胞内递送，具备良好的基因沉默效率与生物安全性，为 RNAi 技术的基础研究与临床转化提供了可靠的载体工具，也为阳离子脂质体的工艺优化提供了参考范式。